竅門(mén)在實(shí)驗(yàn)室中無(wú)處不在。

如：平行作不同樣本的PCR,模板DNA加量一樣，配置PCR體系可以一起配制后分裝----這點(diǎn)做過(guò)試驗(yàn)的都知道，但是配制的時(shí)候配制量可以比預(yù)期分裝量稍多一點(diǎn)(如用100微升則配110微升)，這樣可以避免有時(shí)候分裝不夠的尷尬，因?yàn)椴煌貏e是大小不同的槍?zhuān)瑫?huì)有誤差。再比如：sds-page膠預(yù)配(APS和TEMED、或者后者先不加)的問(wèn)題，實(shí)際上時(shí)間放置過(guò)長(zhǎng)肯定影響效果，如果要在一天內(nèi)連續(xù)地跑兩次板，何嘗不可?又比如，配sds-page膠的時(shí)候，上層膠和下層膠可以只用一個(gè)大槍頭：先取膠，次取水，取6.8的tris后再取8.8的tris，省時(shí)省料。

但我想，“竅門(mén)”和“偷懶”不應(yīng)該是因果關(guān)系。其實(shí)，不管是那一類(lèi)的小竅門(mén)，都是在充分地理解實(shí)驗(yàn)各步驟的原理、經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)積累、再加上一點(diǎn)點(diǎn)思索然后嘗試的結(jié)果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索，是根本。否則，別人的小竅門(mén)對(duì)你也未必能夠有用。才進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的新手，務(wù)必要先練好規(guī)范扎實(shí)的操作，然后才能弄“竅門(mén)”。本末倒置，貽害無(wú)窮。

1. SDS －PAGE的積層膠

分離膠預(yù)先配成mixture，APS制膠時(shí)加入，半年內(nèi)使用，沒(méi)有問(wèn)題，我保證。

2. 做SDS-PAGE的時(shí)候

除了蛋白量上樣一致，體積也一致，這樣跑出來(lái)的膠各個(gè)泳道之間的band能做到一樣寬，方便后面的比較，特別是WB。做法就是拿1X的上樣緩沖補(bǔ)全要加的樣做到體積一致，否則跑出來(lái)會(huì)有的寬有的窄，特別是上樣體積相差較大的。

3. 在把蛋白膠做成干膠時(shí)

很多時(shí)候會(huì)因?yàn)橛袣馀菔鼓z裂掉，我的經(jīng)驗(yàn)是在做膠時(shí)加上層膜前在膠上多加些水就不容易進(jìn)氣泡了，還有就是高溫烘膠，我喜歡放到60度烘箱里烘，這樣水分蒸發(fā)速度快，即使有一些小的氣泡也不會(huì)有影響，呵呵，這是經(jīng)驗(yàn)之談，我從來(lái)都沒(méi)失手過(guò)，大家可以試試。

4. 做大腸表達(dá)時(shí)

確定蛋白是否表達(dá)一般要煮樣做誘前誘后檢測(cè),但很多時(shí)候煮出來(lái)的很黏影響跑膠效果.我發(fā)現(xiàn)如果現(xiàn)用8M Urea重懸細(xì)菌再煮效果會(huì)有極大改善。

注:不能用Gu-HCl代替。

5. 幾個(gè)偷懶的方法

1. 做SDS-PAGE跑膠通常都是現(xiàn)配現(xiàn)用,但配膠要>1h,所以如果想第二天睡個(gè)懶覺(jué)而又不耽誤跑膠可以于前一天晚上做好濃縮膠和分離膠,待凝聚后不要拔下梳子,把含膠玻璃板從制膠槽取下,用保鮮膜包上,注意玻璃板上下兩邊緣會(huì)有氣體,所以需要加一點(diǎn)電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā).然后放4度過(guò)夜.第二天直接拔下梳子行后續(xù).國(guó)外好多公司出售腳既是如此,可以保存上星期。

2. 配置分離膠或者非變性膠時(shí)因膠凝時(shí)收縮可導(dǎo)致加樣孔變淺.可以將加剩的膠放入4度以降低凝聚速度,而將凝膠放入37度促聚,并隨時(shí)用4度加剩的膠補(bǔ)充下降的膠面.另外將膠橫放與水平面成~10度角也可以減少收縮的影響。

3.推薦一個(gè)節(jié)約抗體/時(shí)間的做法:

同時(shí)跑2塊膠,同時(shí)轉(zhuǎn)膜,然后兩塊膜背靠背放入同一封口膜同時(shí)封閉,同時(shí)一抗二抗(是用轉(zhuǎn)輪,這樣效果好.如果是搖床,隔一段時(shí)間幫它們翻個(gè)身以保證兩張膜的正面都有機(jī)會(huì)與液體充分接觸.一起洗膜(可以稍微加強(qiáng)洗膜也可以不做.我多一張盤(pán)子里放4張膜而沒(méi)有影響洗膜).可分別或同時(shí)壓片.這樣就可以節(jié)約一半抗體和接近一半時(shí)間而不會(huì)影響結(jié)果。

或者另外一個(gè)就是孵育后的抗體不要扔,好的抗體可以反復(fù)做好幾張膜呢.但每次都會(huì)減弱,效果不如上面一種方法。

6. 做western blotting 轉(zhuǎn)膜時(shí)

膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時(shí)間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝 好轉(zhuǎn)膜裝置，我的經(jīng)驗(yàn)是把膜印在膠上直接在膜上畫(huà)出預(yù)染maker條帶，方便的很。因?yàn)楹芏鄷r(shí)候跑電泳時(shí)膠上的預(yù)染maker很清楚，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過(guò)要注意畫(huà)好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對(duì)位移動(dòng)了，以防m(xù)aker失去參照價(jià)值。

7. 超濾合適用于蛋白的濃縮

更換緩沖液和除鹽，對(duì)于按照分子量進(jìn)行初分離的效果不是很好，理論和現(xiàn)實(shí)是有很大差別的。

8. 關(guān)于Western Blot

1)器具的清潔非常重要，開(kāi)始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來(lái)水反復(fù)沖洗，確保無(wú)洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2-3遍，然后用去離子水沖洗一遍。后用95%酒精再擦一遍后晾干備用。

2)配膠現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠(分離膠)，后配上層膠(濃縮膠或積層膠)，而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1-2次即可。

9 跑蛋白page的時(shí)候

一開(kāi)始用加樣針，太麻煩，發(fā)現(xiàn)用20ul槍+普通小白槍頭點(diǎn)，非常省事。另外，點(diǎn)樣時(shí)有可能看不清孔在哪，看遠(yuǎn)離你的那面膠，孔有反光的。點(diǎn)樣也點(diǎn)你對(duì)面的那塊膠，省的總低頭，干咱這行的容易得頸椎呀，愛(ài)惜自己。

10. 垂直電泳時(shí)

可在電泳糟中放入青霉素小瓶等，可自然使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液。

11. 我們有時(shí)要沉淀東西時(shí)

由于沉淀量很少，離心完之后不知道到底有沒(méi)沉淀下來(lái)東西，由于量很少，不好觀察，所以離心時(shí)建議按特定的方向放置離心管，這樣你就可以在離心之前確定沉淀該沉淀到管子的大致部位，這樣離心后就可直接觀察那有沒(méi)有沉淀，避免滿(mǎn)管子找，另外看沉淀時(shí)可以對(duì)光看，這樣就是顆粒狀的細(xì)小沉淀也能看見(jiàn)的。

12. 大家都知道PMSF有毒

以前都是知道濃度和要配的體積的基礎(chǔ)上,算出要稱(chēng)多少毫克的PMSF,其實(shí)也可以先稱(chēng)PMSF,稱(chēng)多少算多少,再調(diào)整異丙醇的體積，到達(dá)你所要的濃度。這樣就避免了你長(zhǎng)時(shí)間和它接觸。

13. 跑好SDS-PAGE膠的一些體會(huì)：

1. 清洗好玻璃板，不要偷懶，很多時(shí)候跑完電泳撬膠時(shí)會(huì)因?yàn)椴ＡО宀桓蓛裟z粘在板上把膠撬破。

2. 配膠時(shí)不要反復(fù)用槍混，稍微搖混就可以了，用槍混多次會(huì)導(dǎo)致膠凝不好影響電泳圖的分辨率。

3. AP分裝成500微升一管保存放-20度，避免AP用太久失效。

4. 倒膠時(shí)把玻璃板中的水用濾紙盡量吸干，因?yàn)槲⒘康乃嬖跁?huì)影響配的膠濃度。

5. 盡量不用過(guò)夜放室溫或者四度的膠，也回影響膠 的分離效果。

6. 電泳完撬膠時(shí)根本不需要用撬膠板，在一平皿里裝好水，把有膠一面的放在水中晃動(dòng)幾次膠很容易就脫落下來(lái)，一點(diǎn)沒(méi)有問(wèn)題，方便的很。

7. 點(diǎn)樣時(shí)樣品別忘了離心這步，因?yàn)樯蠘雍泄腆w沉淀會(huì)影響電泳圖分辨效果。

8. 盡量在冰浴狀態(tài)下跑。

14. 關(guān)于２－ＤＥ

總結(jié)了幾個(gè)小竅門(mén)：

1.一向電泳時(shí)，鹽離子容易聚在　膠槽的兩側(cè).剪一小段IPG膠條放在兩側(cè)，構(gòu)成鹽橋，電壓就容易上去了。避免一向電泳不好影響后實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2. SDS-PAGE時(shí),在灌膠之前,一般大家都會(huì)用凡士林封底, 在SDS-PAGE電泳之前又必須把凡士林搽干凈,很是麻煩,我的經(jīng)驗(yàn)是:不用凡士林,取少量未加Ap的分離膠,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板間,等上幾分鐘,待膠凝固后就可以接著灌分離膠方面,效果好!

15. 蛋白質(zhì)純化時(shí)

蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān)，之前建議加pmsf，建議在上柱子洗脫的時(shí)候也加pmsf(蛋白降解抑制劑)，一定要用之前再加。

16. 做透析的時(shí)候

拿一個(gè)5ml的槍頭或者是其他類(lèi)似的東西，剪短，穿過(guò)個(gè)塑料泡沫之類(lèi)的面積比燒杯大東西，然后把透析帶一端扎緊，另一端開(kāi)口綁緊在5ml槍頭下端，扎緊得那端也可以彎過(guò)來(lái)綁成u字型。這樣就可以用1ml的槍穿過(guò)5ml的槍頭的孔，另一只手調(diào)整透析帶，來(lái)加樣取樣，省去了總綁透析帶的麻煩，對(duì)同一個(gè)蛋白大量多次透析非常方便

17. 自己的實(shí)驗(yàn)技巧

1. 配SDS-PAGE膠時(shí)，用槍頭混勻比較麻煩，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效果也不好。可以剪一小段夾文件的那種曲針做轉(zhuǎn)子放到配膠的小燒杯里，在磁力攪拌器上邊攪邊加入各溶液，這樣加完也就混勻了，直接灌膠即可。

2. 上面的站友也說(shuō)過(guò)，上樣用黃槍頭就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建議大家也試試。

3.電泳后考馬斯亮藍(lán)染色一般要1h到2h，脫色也要2h左右，麻煩的很?，F(xiàn)在給大家說(shuō)一個(gè)簡(jiǎn)單的方法，是我從一個(gè)師姐那里學(xué)到的。加入染色液后，先放入微波爐里加熱5-10秒，使染色液微熱即可(千萬(wàn)不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了)。然后放水平搖床上搖20分鐘，多半小時(shí)就染好了。

脫色也很簡(jiǎn)單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐里煮沸5分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點(diǎn)點(diǎn)，不如那樣清楚，只要電泳時(shí)比平時(shí)多上1/5的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時(shí)省材料(用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液)。